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高速离心机用于质粒DNA的提取

2016/5/26 23:10:46      点击:

  DNA的提取设备     离心机     电泳设备   凝胶成像系统

    1 实验前准备
    用酒精棉球对实验操作台进行擦拭即可.

    2 菌体收集
    用1.5mlEP管对过夜培养的大肠杆菌进行菌体收集,收集两次约2.5ml过夜培养的菌液(有时根据菌液浓度适当调整);取过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000 rpm离心1 分钟,后倒掉上清,进行第二次收集,重复第一次实验操作;

    3 菌体重悬
    向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl 溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用200ul移液枪彻底悬浮细菌沉淀。注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。

    4 菌体裂解
    向离心管中加入250 μl 溶液P2,及时温和地上下翻转3-4次使菌体充分裂解,要及时,是防止局部裂解。注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,造成提取的质粒中混有基因组DNA 片断。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5 分钟,以免质粒受到破坏。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。

    5 中和反应
    向离心管中加入350 μl 溶液P3(主要是些NacooH,中和溶液2中的碱),立即温和地上下翻转3-4 次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。注意:P3 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

    6 柱子平衡
    拿出吸附柱和收集管,将吸附柱套入入收集管中,向吸附柱CP3 中加入500μl 的平衡液BL,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

    7 离心去除沉淀
    将第五步骤中和反应后的溶液,用12,000 rpm (~13,400×g )离心15 分钟去除菌体裂解后的残留蛋白和基因组DNA,时其在离心管底部形成沉淀,质粒分布于上清液。

    8 质粒过柱纯化
    将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3 中 (吸附柱放入收集管中),注意尽量不要转移出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3 放入收集管中。

    9 漂洗
    向吸附柱CP3 中加入600 μl 漂洗液PW(检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。(一般漂洗两次)。

    10 空甩
    一般在漂洗后要进行一次的空甩,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,具体是12,000 rpm (~13,400×g) 空甩离心2 分钟,后置于室温放置数分钟。

    11 洗脱DNA
    取干净的离心管,将吸附柱CP3 置于干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50μl事先温浴的洗脱缓冲液,室温放置2 分钟,12,000 rpm (~13,400×g) 离心1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。

    12 琼脂糖电泳检测提取质粒质量
    事先配制好1%浓度的琼脂糖电泳凝胶。取3ul上步骤提取的质粒,点样,200V电压 电泳15min,后于成像系统观察。